تتحرك من المتوسط - يماغيج

صورة كثافة معالجة السطوع هو الإدراك البصري للضوء المنعكس. زيادة السطوع يشير إلى الصور زيادة الإنارة. التباين هو فصل الأجزاء الأخف وزنا والأحمر من الصورة. زيادة في التباين سوف تلقي بظلالها على الظلال ويبرز الضوء. يستخدم التباين المتزايد عموما لجعل الكائنات في صورة أكثر تميزا. اضبط السطوع والتباين مع إيماج أدجوست بريتنيسكونتراست. لجعل التصور من الصورة أسهل. اضغط على الزر أوتو (تلقائي) لتطبيق امتداد التباين الذكي على شاشة العرض. يتم ضبط السطوع والتباين من خلال الأخذ في الاعتبار الرسم البياني الصور. إذا ضغطت مرارا وتكرارا، الزر يزيد من نسبة بكسل المشبعة. زر إعادة تعيين يجعل الحد الأقصى 0 والحد الأدنى 255 في الصور 8 بت والحد الأقصى والحد الأدنى يساوي أصغر وأكبر بكسل القيم في الرسم البياني الصور للصور 16 بت. إذا لم ينتج زر أوتو نتيجة مرغوب فيها، فاستخدم أداة المنطقة ذات الفائدة (روي) لتحديد جزء من الخلية وبعض الخلفية، ثم اضغط على الزر تلقائي مرة أخرى. ثم سيتم بناء على امتداد شدة العائد على الاستثمار. يؤدي الضغط على الزر أبلي (تطبيق) إلى تغيير القيم الرمادية الفعلية للصورة بشكل دائم. إذا كان مجرد تحليل كثافة الصورة لا تضغط على هذا الزر. إذا كنت تفضل أن يتم عرض الصورة على أنها سوداء على الأبيض بدلا من الأبيض على أسود، ثم استخدام الأمر مقلوب: جداول بحث الصور عكس لوت. يقوم الأمر إديت إنفرت بتحويل قيم البكسل نفسها بشكل دائم. الحصول على قيم كثافة من عائد الاستثمار واحد إذا كان العمل مع كومة، يمكن تحليل العائد على الاستثمار المختارة مع الأمر: صورة مداخن مؤامرة Z محور الملف. هذا يولد عمود واحد من الأرقام - كثافة شريحة واحدة في الصف الواحد. أعلى 6 صفوف من العمود هي تفاصيل عائد الاستثمار. وهذا يجعل من عدم تحليل نفس العائد على الاستثمار مرتين ويسمح لك لانقاذ أي روي مثيرة للاهتمام. وتتألف التفاصيل من المنطقة، x - تنسيق، y - تنسيق، أر، الاستدارة، وصلابة عائد الاستثمار. إذا كان عائد الاستثمار هو عائد الاستثمار بولينيغفريهاند بدلا من سكاريغتوفال، فإنه يعمل كما لو كان العائد على الاستثمار هو أوفالغسكوار. يمكن استعادة عائد الاستثمار (البيضاوي) عن طريق إدخال التفاصيل التي يطالب بها الأمر تحديد اختيار استعادة الاستعادة (هوتكي: كترل شيفت E). يتم عرض النتائج في نافذة مؤامرة مع تفاصيل عائد الاستثمار في عنوان نافذة المؤامرة. مؤامرة تحتوي على قائمة الأزرار، حفظ، نسخ. الزر كوبي يضع البيانات في الحافظة بحيث يمكن لصقها في ورقة إكسيل. يمكن العثور على إعدادات زر النسخ ضمن خيارات تحرير خيارات المؤامرة الشخصية. وتشمل الإعدادات الموصى بها: لا حفظ X - القيم (يمنع شريحة رقم البيانات التي تم لصقها في إكسيل) و أوتوكلوس بحيث لم يكن لديك لإغلاق مؤامرة تحليلها في كل مرة. الكثافة الديناميكية مقابل تحليل الوقت البرنامج المساعد قطعة Z محور الملف الشخصي (وهذا هو Z ملف التعريف من كيفن (غالي) بالر (غليبلر في ياهو) واين راسباند ببساطة إعادة تسميته) سوف رصد كثافة العائد على الاستثمار تتحرك باستخدام أداة تتبع الجسيمات. يمكن أن تكون هذه الأداة إما يدوية أو تلقائية. استخدام الصورة مكدس مؤامرة Z محور الملف الشخصي. الحصول على قيم كثافة من روي متعددة يمكنك تحليل عوائد الاستثمار متعددة في وقت واحد مع بوب دوغيرتيس متعدد المساعد البرنامج المساعد. وظيفة مدير العائد على الاستثمار الأم لا وظيفة مماثلة إلا لا تولد النتائج في الأعمدة فرزها. تحقق من موقع بوبس للحصول على التحديثات. و مولتي قياس المساعد الذي يأتي مع التثبيت هو v3.2. فتح متحد البؤر سلسلة وإزالة الخلفية (انظر تصحيح الخلفية) توليد كومة مرجعية لإضافة روي. استخدم وظيفة Z-بروجيكت Z-بروجيكت وحدد متوسط. إعادة تسمية هذه الصورة شيء لا تنسى. افتح المكون الإضافي لإدارة عائد الاستثمار (تحليل أدوات روي ماناجر أو رمز شريط الأدوات). حدد رويز وأضف إلى مدير عائد الاستثمار. انقر فوق الزر إظهار الكل للمساعدة في تجنب تحليل نفس الخلية مرتين. بعد اختيار روي أن يتم تحليلها في الصورة المرجعية، يمكنك رسمها إلى الصورة المرجعية عن طريق النقر على زر موريغتغ واختيار رسم. حفظ الصورة المرجعية إلى مجلد بيانات التجارب ثم انقر على كومة ليتم تحليلها. انقر فوق الزر موريغتغت في مدير عائد الاستثمار وحدد زر قياس متعدد لقياس جميع عوائد الاستثمار. انقر فوق موافق . سيضع هذا القيم من كل شريحة في صف واحد مع أعمدة متعددة لكل شريحة. النقر على قياس جميع شرائح 50 وضع جميع القيم من جميع شرائح ولكل عائد استثمار في عمود واحد. انتقل إلى نافذة النتائج وحدد عنصر القائمة تحرير تحديد الكل. . ثم إديتكوبي. انتقل إلى إكسيل والصق في البيانات. تحقق من أن كل شيء تم لصقه بشكل صحيح 10. لنسخ عائد الاستثمار في جدول بيانات إكسيل، يجب أن يكون هناك صف فارغ فوق بيانات الكثافة. استخدم مربع الحوار متعدد القياسات وانقر على زر نسخ القائمة. 14. في إكسيل، انقر فوق الخلية الفارغة فوق عمود البيانات الأول والصق في إحداثيات عائد الاستثمار. حفظ عوائد الاستثمار مع زر قياس متعدد حفظ. وضعها في مجلد البيانات التجريبية. يمكن فتح عوائد الاستثمار في وقت لاحق إما بشكل فردي مع زر فتح أو في كل مرة مع زر فتح الكل. يمكن استعادة عوائد الاستثمار البيضاوي والمستطيلة بشكل فردي من x، y، l، h القيم مع الإضافات العائد على الاستثمار تحديد عائد الاستثمار. أمر. يقارن التصوير الراتيومي بين تسجيلات إشارتين مختلفتين لمعرفة ما إذا كانت هناك أي أوجه تشابه بينهما. ويتم ذلك بتقسيم قناة واحدة بواسطة قناة أخرى لإنتاج قناة راتيومترية ثالثة. هذه التقنية مفيدة لأنه يصحح لصبغة التسرب، تحميل الصبغة غير المتكافئة، وتبييض الصور. على سبيل المثال تطبيق قياس أيون الخلايا، ودرجة الحموضة، والديناميات الجهد في الوقت الحقيقي. وهناك حاجة إلى الطرح الخلفية قبل تحليل الصور نسبة مزدوجة القناة. انظر أيضا قسم تصحيح الخلفية. سوف البرنامج المساعد راتيوبروفيلر إجراء تحليل راتيوميتريك من عائد استثمار واحد على كومة معركة مزدوجة القناة. الشرائح الفردية هي قناة 1 الصور والشرائح حتى هي قناة 2 الصور. إذا تم فتح قناتك كأكوام منفصلة، ​​مثل زايس، يمكن تشابك القناتين (مختلطة معا عن طريق التناوب بينهما) مع الأمر القائمة الإضافات مكدس - خلط كومة التشذير. سوف البرنامج المساعد توليد الأخضر مؤامرة من قيم النسبة. CH1Ch2 هو الافتراضي ويمكنك الحصول على CH2Ch1 إذا تم تشغيل البرنامج المساعد مع مفتاح ألت إلى أسفل. وسوف تولد أيضا مؤامرة الثانية من شدة القنوات الفردية، CH1 و CH2، فضلا عن جدول النتائج. يحتوي الصف الأول من جدول النتائج على قيم ل x و y والعرض وارتفاع عائد الاستثمار. من الصف الثاني إلى الأسفل، العمود الأول هو الوقت (رقم شريحة)، والعمود الثاني هو كثافة متوسط ​​CH1، والقناة الثالثة هي شدة متوسط ​​CH2 وقيمة النسبة. يجب أن يكون كومة الفاصل الزمني الإطار معايرة من أجل قيمة الوقت لتكون في ثوان. خلاف ذلك، فمن شرائح. يمكن تعيين الفاصل الزمني للإطار للمكدس عبر أمر القائمة خصائص الصورة. يمكن نسخ هذا الجدول إلى الحافظة ولصقه في مكان آخر باستخدام الأمر "تحرير نسخ الكل". تحليل نسبة باستخدام مدير روي 1.Subtract الخلفية من الصورة. 2- افتح مدير عائد الاستثمار (مدير تحليل عائد الاستثمار). وانقر على الزر إظهار الكل. 3. حدد الخلايا التي سيتم تحليلها وإضافتها إلى مدير العائد على الاستثمار (إضافة زر أو لوحة المفاتيح مفتاح T). 4. تشغيل البرنامج المساعد. تحتوي نافذة النتائج على متوسط ​​ch1 و ch2 ونسبتهما. كل صف هو تيمبوانت (شريحة). يحتوي الصف الأول على تفاصيل عائد الاستثمار. لتوليد صورة مرجعية: قم بتسطيح المكدس بأمر القائمة) صورة مداخن Z-بروجيكت مع نوع العرض: ماكسيموم (، اضبط السطوع والتباين إذا لزم األمر. حدد الصورة الجديدة وانقر على الزر المزيد في مدير عائد الاستثمار. بعد ذلك حدد التسمية. الحصول على البيانات الطابع الزمني و لسم الأدوات هو مشروع تهدف إلى دمج وظائف مفيدة مشتركة حول تنسيق ملف زايس لسم، التي ينبغي أن تعزز قابلية استخدام ملفات لسم مبائر أبقى في شكلها الأصلي، وبالتالي الحفاظ على كل ما وراء البيانات المتاحة. في فيجي، الأوامر المقابلة هي: فيل إيمبورت شو لسمتولبوكس الذي يعرض مربع الأدوات، والذي يمكن من خلاله تسمية كافة الأوامر و المساعدة حول الإضافات لسمتولبوكس. الذي يعرض معلومات حول البرنامج المساعد. يمكن العثور على هذه القراءة باستخدام أمر القائمة إيماج شو إنفو. . انتقل لأسفل للحصول على الوقت تم الحصول على كل شريحة. حدد هذه المرة، ونسخها إلى إكسيل، والعثور على رقم الوقت الذي تم الحصول عليه باستخدام أمر القائمة إكسيل تحرير استبدال. سيترك هذا فقط بيانات الوقت. ويمكن بعد ذلك حساب الوقت المنقضي بطرح الصف 1 من جميع الصفوف اللاحقة. لينسككانينغ ينطوي على الحصول على سطر واحد، بكسل واحد في العرض، من المجهر متحد البؤر مشترك بدلا من صورة 2D القياسية. وعادة ما تكون هذه طريقة أسرع لالتقاط صورة. ثم يتم مكدسة كل الصور بكسل واحد على نطاق واسع لإعادة صورة 2D. جيل زائف لينسكان من صورة ثلاثية الأبعاد (x، y، t). ومن المفيد لعرض البيانات 3-D في 2 أبعاد. يتم رسم خط الاهتمام يليه الأمر: صورة مكدس ريسليس أو مع زر لوحة المفاتيح. وسوف يطلب منك عرض الخط الذي ترغب في أن يكون متوسط. وسوف تولد كومة الزائفة لينكسكان مع كل شريحة تمثل الزائفة لينسكان من خط واحد بكسل واسعة على طول خط الاهتمام. متوسط ​​كومة الزائفة-الخطوط عن طريق تحديد صورة مداخن Z - المشروع. واستخدام الأمر متوسط. يمكن استخدام خط متعدد، ولكن هذا سيولد شريحة بكسل واحدة فقط. تفترض الإعدادات الافتراضية فيجيس أن الأكوام هي z - series بدلا من t - series. وهذا يعني أن العديد من الوظائف المتعلقة بالبعد الثالث من كومة الصورة يشار إليها ب z. فقط إبقاء هذا في الاعتبار. فراب (الانتعاش مضان بعد فوتوبلاشينغ) تحليل سوف المساعد فراب المحلل تحليل كثافة العائد على الاستثمار ابيض مع مرور الوقت وتطبيعه ضد شدة الخلية بأكملها. بعد ذلك سوف تجد الحد الأدنى من كثافة في العائد على الاستثمار ابيض وتتناسب مع الانتعاش مع هذه النقطة في الاعتبار. افتح مدير عائد الاستثمار. ارسم حول عائد الاستثمار المبيض وأضفه إلى مدير عائد الاستثمار. رسم حول الخلية بأكملها وإضافة ذلك إلى مدير العائد على الاستثمار. ويصحح التطبيع للتبييض الذي يحدث أثناء الحصول على الصور ويفترض أن الخلية كلها في مجال الرؤية. يفترض البرنامج المساعد أكبر من عائد الاستثمار اثنين في مدير العائد على الاستثمار هو عائد الاستثمار الخلية بأكملها وأن العائد على الاستثمار أصغر هو جزء ابيض. شغل المكون الإضافي فراب بروفيلر. سوف البرنامج المساعد يعود كثافة مقابل مؤامرة الوقت، وكثافة تطبيع مقابل مؤامرة الوقت من منطقة ابيض، ومناسب منحنى. تباين غير خطي يمتد إيكاليزاتيون يمكنك الحصول على مزيد من التحكم في تعديلات السطوع والتباين مع الأمر بروسيس إنهانس كونتراست مينو. مع كومة، فإنه يحلل كل الشرائح الرسم البياني لإجراء التعديل. ويطبق الأمر إكاليز كونتراست امتدادا غير خطي للممر البياني استنادا إلى الجذر التربيعي لشدته. غاما ينفذ تعديل الرسم البياني غير الخطية. الأجسام الخافتة تصبح أكثر كثافة بينما الكائنات الساطعة لا (غاما lt1). أيضا، الأجسام متوسطة الكثافة تصبح أكثر غمارة في حين أن الأشياء الساطعة لا (غاما غ 1). يتم رفع كثافة كل بكسل إلى قوة قيمة غاما ثم تحجيمها إلى 8 بت أو الحد الأدنى والحد الأقصى للصور 16 بت. ل 8 صور بت كثافة جديدة 255 (كثافة قديمة 255) غاما يمكن تعديل غاما من خلال الأمر عملية الرياضيات غاما. وسوف تسمح لك لضبط غاما مع شريط التمرير. انقر على "موافق" عند الانتهاء. يمكنك استخدام شريط التمرير لتحديد قيمة غاما المطلوبة على شريحة واحدة من المكدس الخاص بك. هناك أيضا خيار لمعاينة النتائج. راجع المرجع عبر الإنترنت للحصول على شرح للمرشحات الرقمية وكيفية عملها. يمكن العثور على عوامل التصفية باستخدام أمر القائمة عوامل التصفية. . يعني مرشح. يتم استبدال بكسل مع متوسط ​​نفسها وجيرانها داخل دائرة نصف قطرها المحدد. عنصر القائمة عملية السلس هو مرشح 33 يعني. فلتر غاوس. هذا مشابه لمرشح تمهيد ولكنه بدلا من ذلك يحل محل قيمة البكسل مع قيمة متناسبة مع التوزيع الطبيعي لجيرانه. مرشح متوسط. يتم استبدال قيمة بكسل مع الوسيط نفسه والجيران المجاورة لها. وهذا يزيل الضوضاء ويحافظ على الحدود أفضل من التصفية المتوسطة البسيطة. عنصر القائمة بروسيس نويز ديسبيكل هو مرشح متوسط ​​33. تصفية الفلتر: يسمح هذا بتضاعف صفيفتين من الأرقام معا. يمكن أن تكون الصفائف أحجام مختلفة ولكن يجب أن تكون ذات البعد نفسه. في تحليل الصور تستخدم هذه العملية عادة لإنتاج صورة الإخراج حيث قيم بكسل هي تركيبات خطية من قيم الإدخال معينة. الحد الأدنى: هذا الفلتر، المعروف أيضا باسم مرشح التعرية، هو مرشح مورفولوجي يعتبر الحي حول كل بكسل، ومن هذه القائمة من الجيران، يحدد الحد الأدنى للقيمة. ثم يتم استبدال كل بكسل في الصورة بالقيمة الناتجة الناتجة عن كل حي. الحد الأقصى: هذا الفلتر، المعروف أيضا باسم مرشح التمدد، هو مرشح مورفولوجي يعتبر الحي حول كل بكسل، ومن هذه القائمة من الجيران، يحدد القيمة القصوى. ثم يتم استبدال كل بكسل في الصورة بالقيمة الناتجة الناتجة عن كل حي. فلتر كالمان. هذا الفلتر، المعروف أيضا باسم التقدير التربيعي الخطي، يعمل بشكل متكرر على مدخلات صاخبة لحساب تقدير إحصائي مثالي لحالة النظام الأساسي. ويمكن إجراء تصحيح الخلفية بطرق متعددة. طريقة بسيطة هي استخدام جداول البحث عن الصور هيلو لوت لعرض قيم صفر كما القيم الأزرق والأبيض (قيمة بكسل 255) كما الأحمر. مع الخلفية التي هي نسبيا حتى عبر الصورة، وإزالته مع الأمر برايتنسكونتراست عن طريق رفع ببطء القيمة الدنيا حتى يتم عرض معظم الخلفية باللون الأزرق. اضغط على زر تطبيق لإجراء تغيير دائم. رولينغ-بال تصحيح الخلفية لإصلاح خلفية متفاوتة استخدام الأمر القائمة عملية طرح الخلفية. وهذا سوف تستخدم خوارزمية الكرة المتداول على خلفية متفاوتة. وينبغي تعيين نصف قطرها على الأقل على حجم أكبر كائن ليس جزءا من الخلفية. ويمكن أيضا أن تستخدم لإزالة الخلفية من المواد الهلامية حيث الخلفية بيضاء. قد يؤدي تشغيل الأمر عدة مرات إلى نتائج أفضل. يمكن للمستخدم اختيار ما إذا كان أو لم يكن لديك خلفية خفيفة، وخلق خلفية مع عدم وجود الطرح، لديها بارابولويد انزلاق، تعطيل تجانس، أو معاينة النتائج. القيمة الافتراضية لنصف قطر الكرة المتداول هي 50 بكسل. بروسيس سوبتراكت Background. Tau علم الأمراض يحفز فقدان الخلايا العصبية المثير، خلل الخلية الشبكة، وعجز الذاكرة المكانية يذكرنا في وقت مبكر مرض الزهايمر هونغون فو 1،4 غوستافو A. رودريجيز 1،4 ماثيو هيرمان 1 شينا إمراني 1 عدن نهماني 1 جيفري باريت 1 هيلين Y فيغويروا 1 إليانا غولدبيرغ 1 S. أبيد حسيني 1،2،4،. كارين E. داف 1،2،3،5،. 1 معهد توب للبحوث حول مرض الزهايمر والدماغ الشيخوخة، المركز الطبي لجامعة كولومبيا، نيويورك، نيويورك 10032، الولايات المتحدة الأمريكية 2 قسم علم الأمراض وبيولوجيا الخلية، المركز الطبي لجامعة كولومبيا، نيويورك، نيويورك 10032، الولايات المتحدة الأمريكية 3 قسم علم الأعصاب التكاملي ، نيويورك، نيويورك 10032، الولايات المتحدة الأمريكية تلقى 20 يوليو 2016. المنقحة 20 أكتوبر 2016. قبلت 15 ديسمبر 2016. متاح على الانترنت 19 يناير 2017. نشرت: 19 يناير 2017 أبرز تاو علم الأمراض يدفع العجز في الذاكرة المكانية في القديم ، ولكن ليس الشباب، والفئران إيك تاو الذين تتراوح أعمارهم بين الفئران إيك تاو المعرض فرط نشاط الشبكة الشبكة وانخفاض دوريات مثيرة، ولكن ليس مثبطة، الخلايا العصبية ميك عرضة لل تاو علم الأمراض يتغير النشاط العصبية يرتبط مع التنكس العصبي في القديم إيك تاو المراحل الأولى من مرض الزهايمر يتميز المرض (أد) من خلال تشكيل التشابك ناضجة في القشرة المخية والارتباك والارتباك عند التنقل في الأماكن المألوفة. يحتوي القشرة المخية الإنسية (ميك) على خلايا عصبية متخصصة تسمى خلايا الشبكة التي تشكل جزءا من نظام الملاحة المكاني. نحن هنا تظهر في نموذج الفأر المعدلة وراثيا معربا عن طافرة الإنسان طاو في الغالب في المفوضية الأوروبية أن تشكيل التشابك ناضجة في الفئران القديمة ارتبط مع فقدان الخلايا استثنائيا والعجز في وظيفة خلية الشبكة، بما في ذلك زعزعة استقرار الحقول الشبكة وانخفاض معدلات اطلاق النار، وكذلك تغيير نشاط الشبكة. ترافق علم الأمراض تاو العلني في الفئران الذين تتراوح أعمارهم بين العجز الذاكرة المكانية. لذلك، تاو علم الأمراض التي بدأت في القشرة المخية يمكن أن يؤدي إلى العجز في إطلاق خلية الشبكة وأساسا لتدهور الإدراك المكاني ينظر في أد الإنسان. تاو علم الأمراض مرض الزهايمر خلايا شبكية القشرة المخية فقدان الخلايا العصبية العجز المعرفي العصبية الليفية التشابك الذاكرة المكانية الكهربية فرط النشاط الشكل 1. الشكل 2. الشكل 3. الشكل 4. نوفمبر 04، 2010 المعلومات التالية هي نسخة محدثة من طريقة لاستخدام إيماجيج لتحليل الغربية بلوتس من صفحة قديمة تم إيقافها الآن. إذا كنت 8217re تبحث عن خيار سير العمل أكثر شمولا لتحليل لطخة غربية الخاص بك، يرجى زيارة بلدي البرنامج التعليمي على استخدام صورة ستوديو لايت. حزمة البرمجيات الحرة من لي-كور العلوم البيولوجية. يمكن تحميل برنامج إيماج ستوديو ليت مجانا من ليكوريسليت. بالإضافة إلى وظائف وصفها أدناه ل إيماجيج، يوفر صورة ستوديو لايت ميزات إدارة البيانات إضافية جنبا إلى جنب مع أدوات الشرح لإنتاج الصور جاهزة للنشر من الغرب الخاص بك. إيماجيج (rsb. info. nih. govijindex. html) يمكن استخدامها لمقارنة كثافة (ويعرف أيضا باسم كثافة) من العصابات على هلام أجار أو لطخة غربية. يفترض هذا البرنامج التعليمي أن كنت قد حملت هلام أو وصمة عار من خلال خطوة التصور، بحيث يكون لديك صورة رقمية من هلام الخاص بك في. tif. JPG. ينغ أو تنسيقات الصور الأخرى (16 بت. tif سيكون الشكل المفضل للاحتفاظ أقصى قدر من المعلومات في الصورة الأصلية). إذا كنت تقوم بفحص فيلم الأشعة السينية على ماسحة مسطحة، تأكد من استخدام ماسح ضوئي مع إمكانية مسح الورق الشفاف (أي فيلم)، واستخدام برنامج الماسح الضوئي لحفظ صور تيف 16 بت. انظر المراجع في نهاية هذا البرنامج التعليمي لمناقشة مختلف الطرق التي يمكنك برغي هذه الخطوة حتى. يفترض هذا أيضا أنك didn8217t تعريض صورة صمة عار عند إنتاجها. للحصول على شرح حول سبب التعرض المفرط لنتائجك، راجع هذه الصفحة. تستخدم الطريقة الموضحة هنا طريقة تحليل جل الموضحة في وثائق إيماجيج: تحليل جل. قد تفضل استخدامه بدلا من الطرق التي أوردها أدناه. وينبغي أن يكون هناك اختلاف بسيط جدا بين النتائج التي تم الحصول عليها من الطرق المختلفة. تم إنشاء هذا الإصدار من البرنامج التعليمي باستخدام إيماجيج 1.42q على ويندوز 7 تثبيت 64 بت. 1. افتح ملف الصورة باستخدام فيلغتوبين في إيماجيج. 2. يتطلب التحليل الروتيني للهلام أن تكون الصورة صورة رمادية. أبسط طريقة لتحويل إلى تدرج الرمادي هو الذهاب إلى ImagegtTypegt8 بت. يجب أن تبدو الصورة الخاصة بك مثل الشكل 1. الشكل 1. فتحت صورة لطخة غربية ملفقة في إيماجيج. تشير المعلومات الموجودة على الجزء العلوي من الصورة إلى أن الصورة حاليا في وضع 8 بت، باستخدام لوت المقلوب (جدول البحث). يضمن لوت المقلوب تسجيل النطاقات المظلمة كقيم كثافة أعلى. .3 اختر أداة الاستطیافات المستطیلة من شریط أدوات إيماجيج. رسم مستطيل حول الممر الأول. يفترض إيماجيج أن الممرات الخاصة بك تعمل عموديا (حتى العصابات الفردية أفقية)، لذلك يجب أن يكون مستطيل طويل القامة وضيقة لإرفاق حارة واحدة. إذا قمت برسم مستطيل قصير وعريض، فسيتحول إيماجيج إلى افتراض أن الممرات تعمل أفقيا (تكون النطاقات الفردية عمودية)، مما يؤدي إلى الكثير من الارتباك. الشكل 2. تم اختيار الممر الأول باستخدام أداة ريكتانغولار سيلكتيونس 4. بعد رسم المستطيل فوق الممر الأول، اضغط على المفتاح 1 (كوماند 1 على ماك) (الأمر 1 على نظام التشغيل ماك) أو انتقل إلى أناليزغتغلزغتسليكت فيرست لين لتعيين المستطيل في المكان. سيتم الآن تسليط الضوء على حارة 1 ولها 1 في منتصف ذلك. 5. استخدم الماوس للنقر مع الاستمرار في منتصف المستطيل على الحارة الأولى واسحبه إلى الحارة التالية. يمكنك أيضا استخدام مفاتيح الأسهم لتحريك المستطيل، على الرغم من أن هذا أبطأ. مركز المستطيل فوق الممر من اليسار إلى اليمين، ولكن don8217t تقلق بشأن بطانة يصل تماما على نفس المحور الرأسي. سيعمل إيماج-J على محاذاة المستطيل تلقائيا على نفس المحور الرأسي كمستطيل 1 في الخطوة التالية. .6 اضغط 2 (كوماند 2 على ماك) أو انتقل إلى أناليزغتغلزغتسيليكت نيكست لين لتعيين المستطيل في مكانه فوق الخط الثاني. سوف تظهر 2 في الممر عند وضع المستطيل. 7. كرر الخطوات 5 6 لكل حارة لاحقة على هلام، والضغط 2 (الأمر 2 على ماك) في كل مرة لضبط المستطيل في مكان (الشكل 3). الشكل 3. ضع المستطيل فوق كل حارة، واضغط 2 في كل مرة لضبط المستطيل في مكانه. 8. بعد تعيين المستطيل في مكان آخر على حارة (بالضغط على 2)، اضغط 3 (كوماند 3 على ماك)، أو انتقل إلى أناليزغتغلزغتبلوت لينيس لرسم مؤامرة الملف الشخصي من كل حارة. الشكل 4. مؤامرة الشخصية من سبيل المثال لطخة غربية. 9 - وتمثل مؤامرة التشكيل الجانبي الكثافة النسبية لمحتويات المستطيل فوق كل ممر. يتم ترتيب المستطيلات من أعلى إلى أسفل على مؤامرة الملف الشخصي. في المثال صورة لطخة غربية، قمم في مؤامرة الشخصية (الشكل 4) تتوافق مع العصابات المظلمة في الصورة الأصلية (الشكل 3). لأن هناك أربع ممرات مختارة، وهناك أربعة أقسام في مؤامرة الشخصية. تمثل قمم أعلى فرقا أكثر قتامة. وتمثل القمم الأوسع نطاقا نطاقات تغطي نطاقا أوسع نطاقا على الهلام الأصلي. 10. صور من المواد الهلامية الحقيقية أو البقع الغربية سوف يكون دائما بعض إشارة الخلفية، وبالتالي فإن قمم don8217t تصل إلى خط الأساس من مؤامرة الشخصية. ويبين الشكل 5 ذروة من صمة عار حقيقية حيث كان هناك بعض الضوضاء الخلفية، وبالتالي فإن الذروة يبدو أن تطفو فوق خط الأساس من مؤامرة الشخصية. سيكون من الضروري لإغلاق الذروة حتى نتمكن من قياس حجمه. الشكل 5. البقع الغربية الحقيقية في كثير من الأحيان بعض الضوضاء الخلفية، وبالتالي فإن الذروة don8217t تصل إلى خط الأساس (أبيض مثالي). 11. اختر أداة تحديد الخط المستقيم من شريط أدوات إيماجيج (الشكل 6). لكل ذروة تريد تحليل في مؤامرة الشخصية، ورسم خط عبر قاعدة الذروة لإرفاق الذروة (الشكل 5). وتتطلب هذه الخطوة حكما شخصيا من جانبك لتحديد المكان الذي تبدأ فيه نهايات الذروة والضوضاء الخلفية. الشكل 6. استخدام أداة خط مستقيم لإغلاق قاعدة كل ذروة من الفائدة. الشكل 7. ويظهر الذروة من الشكل 5 مع خط رسمها عبر قاعدة الذروة لإرفاق منطقة الذروة. 12. لاحظ أنه إذا كان لديك العديد من الممرات الضوء، سيتم إخفاء الممرات في وقت لاحق في الجزء السفلي من نافذة المؤامرة الشخصية. لمشاهدة هذه الممرات، اضغط مع الاستمرار على شريط المسافة، واستخدم الماوس للنقر واسحب مؤامرة الملف الشخصي صعودا. 13. عند إغلاق كل ذروة في القاعدة باستخدام أداة اختيار الخط المستقيم، حدد أداة العصا من شريط أدوات إيماجيج (الشكل 8). الشكل 8. اختر أداة العصا لتمييز كل ذروة اهتمام على مؤامرة الملف الشخصي. 14. باستخدام المسافة والماوس، اسحب مؤامرة الملف الشخصي إلى الوراء حتى تعود إلى الممر الأول. مع أداة العصا، انقر داخل الذروة (الشكل 9). كرر هذا لكل ذروة كما تذهب أسفل مؤامرة الشخصية. بالنسبة لكل ذروة تسلط الضوء عليها، يجب أن تظهر القياسات في نافذة النتائج التي تظهر. الشكل 9. انقر داخل الذروة الأولى من الفائدة مع أداة العصا. وينبغي تسليط الضوء على ذروة وينبغي أن يطفو على القياس في نافذة النتائج. 15. عندما تم تسليط الضوء على جميع القمم، انتقل إلى أناليزغتجلزغتلابيل قمم. هذا يصنف كل ذروة مع حجمها، وأعرب كنسبة مئوية من الحجم الكلي لجميع قمم سلط الضوء عليها. 16. يمكن نقل القيم من نافذة النتائج (الشكل 10) إلى برنامج جدول بيانات عن طريق تحديد إديتجتكوبي آل في إطار النتائج. الصق القيم في جدول بيانات. الشكل 10. الناتج من اختيار قمم في مؤامرة الشخصية ووضع العلامات القمم. في هذه الحالة، والنتائج هي من اختيار الفرقة العليا في كل من الممرات 4 في سبيل المثال لطخة غربية من الشكل 1. ملاحظة: إذا كنت عن طريق الخطأ انقر في المكان الخطأ مع العصا. لا يزال البرنامج يسجل أن منطقة النقر كذروة، وسوف عامل في المساحة الإجمالية المستخدمة لحساب قيم النسبة المئوية. من الواضح أن هذا سوف تحرف النتائج الخاصة بك إذا قمت بالنقر فوق المناطق التي قمم aren8217t. إذا كنت لا يحدث النقر في المكان الخطأ، انتقل بسيط إلى أناليزغتلغلغلابيل قمم لرسم النتائج الحالية، الذي يعرض القيم غير صحيحة، ولكن الأهم من ذلك يعيد عداد نافذة النتائج. العودة إلى مؤامرة الشخصية والبدء في النقر داخل قمم مرة أخرى، بدءا من ذروة 1 من الفائدة. يجب أن تكون نافذة النتائج واضحة وتبدأ في عرض القيم الجديدة. عندما you8217 تأكد من أنك 8217ve انقر في جميع القمم الصحيحة دون النقر عن طريق الخطأ في أي مناطق خاطئة، يمكنك العودة إلى أناليزغتغلزغتلابيل قمم والحصول على النتائج الصحيحة. تحليل البيانات مع البيانات الخاصة بك لصق في جدول بيانات، يمكنك الآن حساب الكثافة النسبية للقمم. كتذكير، والقيم المحسوبة من قبل إيماجيج هي الأرقام التعسفية أساسا، لديهم معنى فقط في سياق مجموعة من قمم التي قمت بتحديدها على صورة هلام واحد you8217ve تم العمل على. ليس لديهم وحدات من البروتين أو أي وحدات أخرى في العالم الحقيقي التي يمكن أن يخطر لك. الإجراء العادي هو التعبير عن كثافة النطاقات المختارة بالنسبة لبعض النطاقات القياسية التي قمت بتحديدها أيضا خلال هذه العملية. 1. ضع بياناتك في جدول بيانات. واحدة من قمم يجب أن يكون المعيار الخاص بك. في هذا المثال we8217ll استخدام الذروة 1 كمعيار. 2. في عمود جديد بجوار العمود "النسبة المئوية"، قسمة القيمة بيرسنت لكل عينة من القيمة النسبة المئوية للمعيار (الذروة الأولى في هذه الحالة، 26.666). 3 - عمود القيم الناتج هو مقياس للكثافة النسبية لكل ذروة، مقارنة بالمعيار، الذي من الواضح أن له كثافة نسبية 1. الشكل 11: حساب الكثافة النسبية لكل قمة من القمم الأربعة المحددة. نستخدم عينة 1 كمعيار لهذا هلام. يتم حساب الكثافة النسبية بقسمة النسبة المئوية لكل عينة بواسطة القيمة المئوية للمعيار. 4. في هذا المثال، حارة 2 لديه كثافة النسبية أعلى (1.86)، والذي يتوافق بشكل جيد مع حجم وظلام من ذلك الفرقة في الصورة الأصلية (الشكل 1). أذكر أن هذه البيانات هي للصف العلوي من العصابات على صورة لطخة غربية الأصلي. 5. إذا كنت ترغب في مقارنة كثافة العينات على المواد الهلامية متعددة أو البقع، وسوف تحتاج إلى استخدام نفس العينة القياسية على كل هلام لتوفير مرجع مشترك عند حساب قيم الكثافة النسبية. انظر الأقسام أدناه لمزيد من المناقشة التفصيلية لهذه المتطلبات. 6. من أجل اختبار الاختلافات الكبيرة بين العلاجات في التجربة، وجميع المواد الهلامية الخاصة بك أو البقع تحتاج إلى مسحها وكميا باستخدام هذه الطريقة، وسيتم التعبير عن القيم من حيث الكثافة النسبية، أو يمكنك علاج الكثافة النسبية كقيمة تغيير أضعاف (أي فرق الكثافة النسبية من 2 بين السيطرة والعلاج تشير إلى تغيير 2 أضعاف في التعبير). إذا كنت سوف تستخدم تحليل تقنيات التباين لاختبار البيانات الخاصة بك، قد تحتاج إلى التأكد من أن قيم الكثافة النسبية الخاصة بك موزعة عادة، وأن هناك تجانس التباين بين مختلف العلاجات. 7. وتجدر الإشارة هنا إلى أن بعض الباحثين بذل المزيد من الجهد لتشمل مجموعة من التخفيفات المسلسل لمعيار معروف على كل وصمة عار. باستخدام منحنى التخفيف المسلسل وتقنيات القياس الكمي المذكورة أعلاه، ينبغي أن يكون من الممكن للتعبير عن العصابات عينة الخاص بك من حيث بيكوغرام أو نانوغرام من البروتين. مثال أكثر تفاعلا باستخدام عناصر التحكم في التحميل. استخدام W8217ll الشكل 12 كما لطخة غربية ممثل. على هذه البقعة، ونحن سوف ندعي أننا تحميل أربع عينات مكررة من البروتين (أربعة أحمال ماصة من نفس القارورة من جناسة)، لذلك نحن نتوقع كثافة في كل حارة أن تكون مكافئة. الصف العلوي من القضبان سيمثل بروتيننا من الفائدة. فإن مجموعة أقل من القضبان تمثل بروتين تحميل التحكم لدينا، والذي يهدف إلى ضمان أن كمية متساوية من البروتين الكلي تم تحميلها في كل حارة. هذا البروتين التحكم للتحميل هو بروتين يفترض أنه على مستوى ثابت بغض النظر عن العلاج المطبق على الكائنات الأصلية، مثل أكتين (على الرغم من أن الكثير من الناس سوف يشكك في التأكيد على أن أكتين سيتم التعبير عنها على قدم المساواة عبر العلاجات). الشكل 12. مثال لطخة غربية مع صف أدنى من نطاقات التحكم والتحكم. وغالبا ما تمثل هذه العصابات بروتينا يعتقد أنه يعبر عنه بالتساوي في جميع العلاجات مثل الأكتين. وبالنظر إلى الشكل 12، كنا نأمل في تحميل كميات مكافئة من إجمالي البروتين في كل حارة، ولكن بعد تشغيل لطخة غربية، وحجم وشدة القضبان السفلية في كل حارة يختلف كثيرا جدا. يبدو أن المسارين الأيسرين متساويين، ولكن الحارة الثالثة لها نصف الكثافة (القيمة الرمادية) بالمقارنة مع الممرات 12، بينما الحارة 4 لها نصف الكثافة ونصف الحجم بالمقارنة مع الممرات 12. لأن ضوابط التحميل لدينا مختلفة جدا، فإن الكثافة قد لا تكون قيم المجموعة العليا من النطاقات قابلة للمقارنة مباشرة. يستخدم W8217ll الروتينية تحليل هلام ImageJ8217s لقياس كثافة وحجم البقع، واستخدام نتائج من تحميل لدينا الضوابط (نطاقات أقل) لتوسيع القيم للبروتين لدينا من الفائدة (العصابات العليا). 1. فتح صورة لطخة غربية في إيماجيج. 2. تأكد من أن الصورة في وضع 8 بت: انتقل إلى ImagegtTypegt8 بت. 3. استخدم أداة المستطيل لرسم مربع حول الخط الأول بأكمله (كل من الشريطين العلوي والسفلي المضمنة.) اضغط على 822018221 (أو الأمر 1 على نظام التشغيل ماك) لضبط المستطيل، يجب أن يظهر 822018221 في منتصف المستطيل. 5. اضغط مع الاستمرار في منتصف المستطيل واسحبه فوق الممر 2. 6. اضغط 822028221 (الأمر 2 على ماك) لضبط المستطيل للممر 2. يجب أن يظهر 822028221 في منتصف المستطيل. كرر الخطوات 5 6 لكل حارة لاحقة، واضغط على 822028221 (كوماند 2 على ماك) لتعيين المستطيل فوق كل حارة لاحقة (انظر الشكل 13) الشكل 13. تم اختيار كل حارة بتحريك المستطيل فوقه والضغط على 822028221 لتعيين .8 عند وضع الممر األخير) واضغط على 822028221 لوضعه في مكانه (، يمكنك الضغط على 822038221 لوضع قطعة من الممرات المختارة) انظر الشكل 14 (. حارة (مرتبة مع حارة 1 في الجزء العلوي، حارة 4 في الأسفل) قد تحتاج إلى التمرير خلال t وقال انه نافذة لرؤية كل من الممرات. 9 - وتمثل مؤامرة المظهر الجانبي أساسا متوسط ​​قيمة الكثافة عبر مجموعة من الشرائح الأفقية لكل ممر. أما البقع الأكثر قتامة فستكون لها قمم أعلى، وأن البقع التي تغطي نطاقا أكبر حجما (كد) سيكون لها قمم أوسع. في مثالنا لطخة غربية، العصابات هي مستطيلات مثالية، ولكن ستلاحظ بعض المنحدرات في قمم المؤامرة الشخصية، كما يطبق إيماجيج قليلا من المتوسط ​​من قيم الكثافة كما يتحرك من أعلى إلى أسفل كل حارة. ونتيجة لذلك، فإن الانتقال الحاد من الأبيض الكامل إلى الأسود المثالي على نطاقات حارة 1 يتم ترجمته إلى منحدر طفيف على مؤامرة الشخصية بسبب المتوسط. 10. على لدينا لطخة غربية مثالية المستخدمة هنا، لا يوجد ضوضاء الخلفية، وبالتالي فإن الذروة تصل على طول الطريق وصولا الى خط الأساس من مؤامرة الشخصية. في البقع الغربية الحقيقية، وسوف يكون هناك بعض الضوضاء الخلفية (الخلفية لن تكون بيضاء تماما)، وبالتالي فإن قمم فاز 8217t تصل إلى خط الأساس من المؤامرة الشخصية (انظر الشكل 5 أعلاه). ونتيجة لذلك، فإن كل مؤامرة تحتاج إلى خط رسمها عبر قاعدة الذروة لإغلاقه. 11. اختر أداة تحديد الخط المستقيم من شريط أدوات إيماجيج. لكل ذروة تريد تحليل في مؤامرة الشخصية، رسم خط عبر قاعدة الذروة لإرفاق الذروة (الشكل 7). وتتطلب هذه الخطوة حكما شخصيا من جانبك لتحديد المكان الذي تبدأ فيه نهايات الذروة والضوضاء الخلفية. 12. عند إغلاق كل ذروة من الفائدة مع أداة خط مستقيم، والتبديل إلى أداة العصا. سوف نستخدم أداة عصا لتسليط الضوء على كل ذروة من الفائدة بحيث الصورة - J يمكن حساب كثافة أرادتها النسبية. 13. وسوف نبدأ من خلال تسليط الضوء على تحميل-السيطرة العصابات (الصف السفلي) على سبيل المثال لدينا لطخة غربية. بدءا من الجزء العلوي من مؤامرة الشخصية، استخدم عصا إلى داخل داخل الذروة 1 (الشكل 15). وينبغي تسليط الضوء على ذروة بعد النقر على ذلك. تابع النقر على قمم التحميل للتحكم في الممرات الأخرى. إذا لم يكن ممر مرئيا في الجزء السفلي من مؤامرة الملف الشخصي، اضغط باستمرار على شريط المسافة وانقر واسحب مؤامرة الملف الشخصي صعودا للكشف عن الممرات المتبقية. الشكل 15. انقر داخل ذروة التحكم في التحميل مع أداة العصا. انقر على كل من قمم التحميل والتحكم للممرات المتبقية (تجاهل الممرات البروتين إلى اليسار في الوقت الراهن). 14. عندما تم تسليط الضوء على ذروة التحكم التحميل لكل حارة مع عصا، انتقل إلى قمم أناليزيغتلغلغابلابيل. سيتم وضع علامة على كل ذروة سلطتها مع حجمها النسبي المعبر عنها كنسبة مئوية من المساحة الكلية لجميع القمم المميزة. يمكنك الانتقال إلى نافذة النتائج واختيار إديتغكوبي آل لنسخ نتائج الموضع في جدول بيانات. الشكل 16. قيم المنطقة والنسبة المئوية لنطاقات التحكم في التحميل من مثال لطخة غربية. الممرات 1 و 2 متساوية، كما نتوقع من خلال النظر في العصابات الأصلية على لطخة غربية (الشكل 12). 15. كرر الخطوات 13 14 لقمم العينة الحقيقية الآن. نحن نختار هذه القمم بشكل منفصل عن قمم التحميل والتحكم بحيث لا يتم أخذ تلك المناطق في الاعتبار في حساب كثافة البروتينات لدينا من الفائدة. كما كان من قبل، استخدم أداة العصا للنقر داخل منطقة الذروة في حارة 1ST، ثم الاستمرار في النقر داخل قمم الممرات المتبقية. عند الانتهاء، انتقل إلى أناليزغتلغلغابل قمم لعرض النتائج. انسخ النتائج إلى جدول بيانات إلى جانب البيانات الخاصة بفرق التحكم في التحميل (الشكل 17). الشكل 17. النتائج من فرق التحكم في التحميل (المسمى 8220stds8221 هنا) وقمم البروتين العينة (الصف العلوي من العصابات على لطخة غربية الأصلي). تحليل البيانات مع فرق التحكم في التحميل 1. مع كل من القيم الكثافة النسبية الآن في جدول البيانات، يمكننا حساب الكميات النسبية للبروتين على لطخة غربية. تذكر أن قيم 8220Area8221 و 8220Percent8221 التي يتم إرجاعها بواسطة إيماجيج يتم التعبير عنها بقيم نسبية، تستند فقط إلى قمم قمت بتحديدها على هلام. بدء التحليل عن طريق حساب قيم الكثافة النسبية لكل من نطاقات التحميل القياسية. في هذه الحالة، we8217ll نتظاهر أن لين 1 هو سيطرتنا أننا نريد لمقارنة 3 الممرات الأخرى ل. تقسيم قيمة النسبة المئوية لكل حارة من قيمة النسبة المئوية في عنصر التحكم (حارة 1 هنا) للحصول على مجموعة من قيم الكثافة التي هي نسبة إلى كمية البروتين في لين 18217s تحميل السيطرة الفرقة (الشكل 18). الشكل 18. احسب قيم الكثافة النسبية بقسمة قيم النسبة المئوية في كل صف بواسطة عينة التحكم 8217s القيمة المئوية (لين 1، 40.828، في مثالنا). 2. التالي we8217ll حساب القيم النسبية الكثافة لعينات البروتين لدينا عينة (الصف العلوي على سبيل المثال لطخة غربية). نقوم بتنفيذ حساب مماثل كخطوة 1، وتقسيم قيمة النسبة المئوية في كل صف من قيمة النسبة المئوية للرقابة لدينا 8217s الفرقة البروتين (حارة 1 هنا). الشكل 19. احسب قيم الكثافة النسبية للعينات كذلك، وذلك باستخدام القيمة المئوية لحزمة البروتين التحكم (لين 1، 40.585 هنا). ملاحظة: نذكر أن بعض من فرق التحكم لدينا تحميل كانت مختلفة بعنف على لطخة غربية الأصلي، يمكننا can8217t ببساطة استخدام قيم الكثافة النسبية من العينات لدينا المحسوبة في الخطوة 2 كما النتائج النهائية. الآن من الضروري لتوسيع قيم الكثافة النسبية للعينات بواسطة الكثافة النسبية لنطاقات التحكم والتحكم المناظرة لكل ممر. ونحن نفعل ذلك استنادا إلى افتراض أن الاختلافات النسبية في الكثافات النسبية من نطاقات التحميل والتحكم تمثل الاختلافات النسبية في كميات من البروتين الكلي الذي حملنا على هلام. في مثالنا لطخة غربية، لدينا أدلة على كميات مختلفة بشكل كبير من البروتين الكلي في كل عينة (ممارسة بيبتينغ الفقراء، وربما). 3. الخطوة الأخيرة هي توسيع نطاق الكثافة النسبية لعيناتنا باستخدام الكثافات النسبية للتحكم في عناصر التحكم. في جدول البيانات، قسمة الكثافة النسبية للعينة لكل ممر بواسطة الكثافة النسبية للتحكم والتحكم في نفس الخط. الشكل 20 تم حساب قيم الكثافة المعدلة (الخلايا الصفراء) لعيناتنا بقسمة الكثافة النسبية لكل ممر عينة بواسطة الكثافة النسبية للتحكم في التحكم لنفس الممر. على سبيل المثال، تم تقسيم الكثافة النسبية للعينة 4 (0.1628) على الكثافة النسبية للتحكم في التحكم في لين 4 (0.154379) للحصول على قيمة الكثافة المعدلة 1.054. 4. عندما أنشأنا مثالنا الخيالي لطخة غربية، توقعنا الحصول على كميات مكافئة من البروتين من الفائدة في كل حارة، لأننا (افتراضيا) تحميل كميات عينة مكافئة من البروتين من نفس القارورة من جناسة في كل حارة. أثناء عملية التحميل، ذهب شيء ما فظيعة، وحصلنا على كثافة مختلفة جدا على لطخة غربية. ولكن بعد إجراء التصحيحات للتحكم في التحميل أعلاه نجد أن الكثافات المعدلة لكل من الممرات الأربع تكافئ تقريبا (كلها تقريبا 1)، مما يشير إلى أن هناك نسبا مكافئة للبروتين من الفائدة الواردة في عينة من المجموع البروتين في كل حارة، كما نتوقع. يمثل المثال أعلاه حالة خاصة. في الواقع، سوف تكون عادة ما تكون ماهرة بما فيه الكفاية لمقادير ماصة ما يعادلها من البروتين الكلي في الممرات هلام، ويفترض لأنك قد استخدمت عملية مثل فحص البروتين بكا لتحديد المبلغ الإجمالي للبروتين الحالي في كل من العينات جناسة الخاص بك. وهذا يمكن أن يلغي الحاجة إلى تحميل والتحكم العصابات والجدل المرتبطة حول ما إذا كان البروتين you8217re تستخدم لتقييم المساواة التحميل وأعرب حقا باستمرار عبر جميع مستويات العلاج. تمديد المثال إلى العديد من البقع الغربية إذا كنت تستطيع تطبيق كميات متساوية من البروتين الكلي لكل ممر من هلام، فأنت بحاجة فقط للقلق نفسك مع وجود عينة القياسية المناسبة وضعت على كل لطخة غربية تشغيل للمشروع. على سبيل المثال، يمكنك شراء قسامة من HSP70 البشري المنقى ووضع 1L في حارة على كل هلام تشغيل عند البحث عن Hsp70. أو قد حفظ بعض المال عن طريق إنشاء عينة القياسية الخاصة بك عن طريق خلط أليكوتس من العديد من المتجانسة الخاصة بك لجعل كمية كبيرة من جناسة المختلطة التي يمكنك استخدامها لتحميل حجم قياسي على حارة واحدة من كل هلام للمشروع بأكمله (تشغيل من هذا الخليط جزء الطريق من خلال المشروع الخاص بك سيكون شيئا سيئا). في هذه الحالة قد لا تعرف التركيز الحقيقي للبروتين من الفائدة في جناسة المختلطة الخاصة بك، ولكن سوف تكون على الأقل قادرة على الحصول على مبلغ مماثل من البروتين الكلي (بما في ذلك البروتين من الفائدة) على كل هلام. والهدف من العينة القياسية هو حساب الاختلافات في كفاءة ملزمة الأجسام المضادة (على سبيل المثال إذا كنت 8217re إعادة استخدام خليط من الأجسام المضادة على العديد من البقع الغربية لتوفير المال)، للتغيرات في الحجب وكفاءة الغسيل، للتغير في معدل الاضمحلال من كاشف تشيميلومينسنت تستخدم لتصور الأجسام المضادة، أو للاختلاف في وقت التعرض للفيلم الأشعة السينية. في أي من هذه الحالات، يمكن أن تختلف شدة الإشارة التي تحصل عليها من لطخة غربية من لطخة إلى لطخة (الشكل 21). يمكنك استخدام عينة قياسية على كل هلام لتطبيع كل فرقة أخرى على نفس لطخة، ومن ثم مقارنة عبر بلوتس متعددة لأن كل فرقة في مجموعة البيانات الخاصة بك هو تطبيع لنفس المعيار (سواء كان 10ng من الإنسان Hsp70 أو خليط من عدة متجانسة ). الشكل 21. مثالين لقطات الغربية مع عينة قياسية مشتركة (لين 1). وقد تباينت خطوات الربط بين هاتين النقطتين بشكل طفيف، مما أدى إلى التعرض النهائي الأخير الذي يغير الكثافات المطلقة على النقطتين. لأن لدينا عينة قياسية على كل من البقع، وهو حجم متطابقة من عينة البروتين متطابقة (أي رسمها من قسامة مشتركة من جناسة)، يمكننا التعبير عن كثافات الممرات الأخرى على كل هلام نسبة إلى العينة القياسية، والقضاء على آثار التعرض المختلف. وأخيرا، إذا كنت تستخدم الفرقة بروتين تحميل التحكم (الصف السفلي على هذه البقع) على كل هلام، وعينة البروتين القياسية على المواد الهلامية متعددة، يمكنك تصحيح كل من الاختلافات في إجمالي البروتين تحميلها في حارة (باستخدام التحميل - نطاق التحكم) والاختلافات في التعرض بين المواد الهلامية (باستخدام العينة القياسية). على سبيل المثال، والنظر في اثنين من المواد الهلامية في الشكل 21. جل (الأبيض) 1 لديه الحد الأدنى من الضوضاء في الخلفية، وهناك بعض الاختلاف كمية البروتين تحميلها في كل حارة، كما يتضح من حجم وكثافة من أشرطة التحكم تحميل من العينات. الممر الأول على اليسار هو لدينا عينة القياسية المستخدمة على كل هلام. الجل 2 (الرمادي) لديه المزيد من الضوضاء الخلفية بسبب وقت التعرض مختلفة، وسوء الغسيل، أو أي عدد من المشاكل المحتملة. مرة أخرى، هناك كميات مختلفة من البروتين محملة في الممرات 4، استنادا إلى حجم وكثافة فرق التحميل والتحكم في النصف السفلي. الممر الأول على اليسار هو نفس عينة البروتين القياسية التي تستخدم على جل 1ST. سنبدأ من خلال تحليل المواد الهلامية اثنين على حدة، وذلك باستخدام البروتوكول في جزء التحميل والتحكم في هذه الوثيقة. 1. احسب الكثافة النسبية لنطاقات التحميل والتحكم (الصف السفلي على هذا الجل). استخدم شريط التحكم في التحميل للمعيار في الحارة 1 للقيام بهذا الحساب. 2. حساب الكثافة النسبية من العصابات للبروتين الفرقة من الفائدة (الصف العلوي على هذا هلام). استخدام الفرقة البروتين من الفائدة للمعيار في حارة 1 للقيام بهذا الحساب. 3. ضبط الكثافات النسبية المحسوبة في الخطوة 2 باستخدام الكثافات النسبية لنطاقات التحكم والتحكم المحسوبة في الخطوة 1. ببساطة تقسيم الكثافة النسبية من الخطوة 2 لكل حارة بالكثافة النسبية المقابلة من الخطوة 1. بعد لك 8217ve تحجيم كثافة of the protein of interest for each sample to the standard sample, and adjusted the relative density based on the loading-control band, you are left with an estimate of the relative density of the protein of interest in each lane on your gel (relative to the standard in lane 1). Repeat this for each separate gel. When finished, you8217ll note that because every sample lane is normalized to the standard sample in Lane 1 on that particular gel, and every gel contains the same standard sample, your cross-gel comparison is already accomplished, since every sample is now normalized to the same standard sample (Figure 22). Figure 22. Example data from two western blots. The Relative Densities of the loading-control bands (lower bands on each gel, red and yellow lines) was calculated, using the value for the standard in Lane 1 (lower band) on each gel. The Relative Densities for the sample bands (upper row on each gel, blue and green lines) were calculated separately, and were normalized relative to the standard in Lane 1 (upper band). The 8220Adjusted Density8221 for each sample lane was calculated by dividing the sample relative density by the loading-control relative density for each lane separately (i. e. for sample 3, 0.1857960.188449 0.98592). After all of this work, you8217re left with (adjusted) Relative Densities for each of your samples (the yellow cells in Figure 22). At this point you can ignore the values of the standard samples, since you only needed those to ensure that your cross-gel comparisons were scaled properly. Now you can finally begin calculating average relative density values for your experimental control samples (maybe these are samples 36) and your experimental treatment samples (perhaps these are samples 14 and 25) to carry out the real comparison of protein expression under your treatment conditions. Because your relative density values are all normalized to the standard sample, you may wish to eventually re-scale your relative density values once again using your experimental controls8217 average value as a baseline. A few extra details: With regard to the ImageJ gel analysis routine, there has been some question of what the values reported by ImageJ correspond to. The images below may help illustrate what Image-J is measuring. Figure 25. A comparison of 8220area8221 values returned by ImageJ. In Figure 25 above, I have drawn out a set of fake 8220bands8221 in Adobe Illustrator. The gray value and area of each band are listed above the band (in this case a lower pixel value darker band). Additionally, I have included the 8220area8221 value returned by Image-J after plotting the bands and clicking in each peak with the Wand tool. Note that these 8220area8221 values are a RELATIVE measure of the size and density of each peak you clicked with the wand tool. When you halve the area of a band, but maintain the same gray value (compare lanes 12), the value reported by ImageJ is half as large. By the same token, if you halve the gray value but maintain the same area (compare lanes 15), the value reported by Image-J is halved. Figure 26. Image-J will return similar area values when bands have equivalent numbers of pixels of equal darkness, but vary in shape. The same holds true for bands of different shapes. In Figure 26 above, altering the shape of the band, but maintaining the same gray value and area (compare lanes 13) yields an equivalent value from ImageJ. Figure 27. Image-J deals with gaps in bands just fine. Note however that the 8220area8221 values returned by ImageJ are different compared to Figure 26 and Figure 27, because the number of lanes, size of the bands, and density of the bands has changed. Image-J also accounts for gaps in a band, as shown in Figure 27 above. Compare lanes 13, which both have an equal number of gray pixels and equal gray values (i. e. equal amounts of protein on the gel). ImageJ reports the same 8220area8221 value for both of these lanes. It is worth reiterating that the 8220area8221 values and percentages reported by Image-J are always relative to the total size and density of bands that you have selected in a particular image. In the image immediately above (Figure 27), the band in column 1 returns an 8220area8221 value of 4000, while in the previous two images column 1 (Figs 25 26) had the same size band, but with twice the gray value, which in both cases also returned a value of 4000. The raw values returned by Image-J are meaningless for comparing across different gels, since they are only a relative measure of the bands you8217ve highlighted on a particular gel image. This is why we need to standardize to some common standard loaded onto all of the gels. Additional references 8211 The methods outlined here are by no means canonical and there are plenty of subtleties to be considered in this sort of analysis. For more practical considerations of scanning and analyzing gel images, see the following papers: Gassmann, M. Grenacher, B. Rohde, B. and Vogel, J. (2009). Quantifying western blots: pitfalls of densitometry. Electrophoresis 30, 1845-1855. doi: Tan, H. Y. and Ng, T. W. (2008). Accurate step wedge calibration for densitometry of electrophoresis gels. Optics Communications 281, 3013-3017. doi: You can follow any responses to this entry through the RSS 2.0 feed. Both comments and pings are currently closed.